Nuevo sistema cuantitativo para la evaluación de vacunas contra el VIH.

 

Silvio Arango-Jaramillo, DVM, Ph.D., Universidad de Johns Hopkins, EE.UU.

 

A pesar de los avances recientes en la Inmunolgía, la Virología, la Biología Molecular, la Genómica y la Proteómica, no se conoce claramente cuales respuestas inmunológicas especificas contra el VIH, son las responsables de la protección.  Por lo tanto la evaluación de inmunógenos candidatos a vacunas constituye un serio problema en la actualidad. Quizás solo una vacuna eficaz, podría definir realmente, cuales son los componentes de la inmunidad inducida por ella. De ahí que tengamos que acudir a sistemas de modelaje in vitro, para lograr reproducir aquellos fenómenos que realmente ocurren, luego de recibir una vacuna experimental.

 

Actualmente son utilizados varios sistemas indirectos o aproximaciones provisionales, para la evaluación de vacunas experimentales anti VIH/SIDA. Varios de estos marcadores tomados en conjunto, conformarían el cuadro que defina si la respuesta inmunitaria está ocurriendo y a qué nivel de intensidad y eficiencia.

 

Hasta el momento, la medida de la carga viral, por medio de la determinación de la cantidad de RNA genómico del virus o por la búsqueda del llamado provirus o DNA viral, proveniente de la trascripción reversa del genoma RNA original del VIH, constituye un marcador importante para el seguimiento de las cohortes de vacunados experimentalmente, determinando si se tornan resistentes a la infección o no. Sin embargo, este es un sistema relativamente burdo, el cual solo nos indicaría si la persona o la población logró ser protegida por la vacuna, observando el resultado final de presencia o ausencia de infección, casi equivalente a la espera por la aparición de síntomas y signos clínicos, los cuales definan si la persona o el grupo poblacional sucumbieron o no al ataque del virus.

 

Una de las pruebas de laboratorio que ha ganado mayor fiabilidad, ha sido la búsqueda de células CD8+ con actividad CTL o linfocitos T citotóxicos, los cuales atacan a las células infectadas por el virus, debido a la expresión de antígenos del VIH en la superficie celular, siendo por lo tanto reconocidas a través del complejo mayor de histocompatibilidad de clase 1. La prueba clásica para CTL, es conocida como el ensayo de lisis y liberación de 51Cr. Este estudio de laboratorio es relativamente complejo y engorroso y por tanto no se realiza rutinariamente en los diversos centros de investigación.

 

La prueba denominada de los tetrámeros, la de ELIspot para Interferon gamma, las técnicas in situ para el hallazgo de Interferon gamma por el sistema de FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter).y el hallazgo de anticuerpos neutralizantes anti VIH completan un grupo selecto de técnicas provisionales para la evaluación de estas vacunas experimentales.

Nuestro grupo acá en la Universidad de Johns Hopkins ha desarrollado y probado un sistema simple y directo, el cual utiliza cultivos de células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSPs), las cuales son retadas in vitro con diversas cepas del VIH-1 para, finalmente, al cabo de 10 días de la descarga viral, medir la producción de la proteína p24 del virus como marcador de la replicación del agente en tales células.

 

El método que denominamos antiguo, lo iniciamos hace casi una década y nos permitía comparar subpoblaciones de CMSPs provenientes de diversos grupos de personas o cohortes, infectadas, o expuestas no infectadas o vacunadas experimentalmente, y compararlas con grupos controles no infectados. Los resultados se presentaban en forma de totales de una fracción o quebrado, en cuyo denominador estaba el total de cultivos tomados y sus réplicas, para determinado subgrupo o cohorte a estudiar, y el numerador estaba constituido por el total de réplicas de cultivos positivos en dicho subgrupo. Esta fracción se comparaba estadísticamente con el quebrado constituido por el respectivo subgrupo control.

 

Este antiguo sistema era una prueba semicuantitativa, usualmente efectuada con 3 ó 4 réplicas de cultivo de las CMSPs de cada persona a estudiar dentro de un subgrupo. Con ella realizamos determinaciones y publicamos resultados, los  cuales indicaban que el mantenimiento de baja viremia en plasma en “Long Term Non Progressors” (LTNPs) correlacionaba con la resistencia in vitro en este ensayo. Así mismo, como en los recipientes de cierta vacuna experimental anti VIH/SIDA, sus células cultivadas y probadas en este ensayo, presentaban una resistencia parcial, la cual era inducida por la vacunación y correlacionaba con actividad CTL.

 

A partir de hace unos meses, establecimos un nuevo sistema  de descarga o reto in vitro, el cual reúne las siguientes características diferenciales: Es un método cuantitativo, en el cual utilizamos en lo posible un mínimo de 8 réplicas por cultivo de cada muestra de una persona. Simultáneamente, realizamos la descarga o reto viral, con un mínimo de tres dosis virales, alta, media y baja, y para el análisis de los resultados se tiene en cuenta un sistema combinado de lectura de dos parámetros: 1. El número de réplicas positivas en la muestra de una persona, y 2. El valor promedio de p24, en aquellas réplicas positivas.

 

Este nuevo método, nos permite juzgar y comparar los resultados no solamente a nivel de grupos o subpoblaciones, sino también a nivel individual, de una persona frente a otra.

 

Para expresar los resultados en forma gráfica, utilizamos un sistema con los dos parámetros mencionados, colocando en el eje de las X, el número de réplicas positivas y en el eje de las Y, el promedio del valor de p24 de aquellas réplicas positivas. Para comparar dos grupos o subpoblaciones, por ejemplo la experimental y una control, se grafican los datos procedentes del ELISA para p24 viral, en forma de puntos o cualquier otro símbolo, correspondientes a las medidas de los dos ejes y luego se inscribe una caja, la cual contenga el percentil 95 superior de los datos para ambos parámetros, para ese subgrupo o cohorte. Dicha caja reemplaza a la curva de distribución de probabilidades de una población, en este caso considerada como con una sola cola, en términos estadísticos, dado que contiene el percentil 95 superior de los datos. También se podría trabajar con el método de dos colas.

 

Es de esperar que los cultivos procedentes de los controles normales se infecten en gran porcentaje y con resultados elevados en cuanto a la cantidad de p24, localizándose los símbolos de dichos datos, hacia la derecha de la gráfica, lo cual indica alto número de réplicas positivas, y simultáneamente hacia la parte alta o superior de la gráfica, indicando el valor alto de la cantidad de p24 presente en aquellas réplicas positivas.

 

Si se espera que el grupo experimental sea relativamente resistente a la infección  por descarga in vitro, o sea diferente al grupo control, los datos se acomodarán hacia la izquierda de los datos de los controles y hacia la parte inferior de la gráfica.

 

Con esta prueba y este tipo de graficación, logramos producir un modelaje que permite estudiar respuestas inmunitarias de resistencia moderada o intermedia, como seria de esperar en el caso de lograr en el futuro inmediato, vacunas que provoquen al menos una respuesta de resistencia parcial o intermedia.

 

Modelaje de la prueba, mediante descarga o reto in vitro de CMSPs procedentes de EUs:

 

Para ello estudiamos un grupo de EUs y otro control, siendo sus células retadas in vitro con dosis baja como con dosis alta del virus. Se demostró cómo los cultivos provenientes de voluntarios con alto riesgo de infección (EUs), aparecían en su mayoría resistentes a la dosis baja, aunque igual acontecía con algunos controles. Sin embargo, la diferencia entre los cultivos positivos entre el grupo de los EUs y el control fue altamente significativa estadísticamente. Una subpoblación de EUs fue probada de nuevo en el ensayo in vitro con un grupo control, para la resistencia a una dosis alta del virus. Como resultado, ninguna muestra procedente de los EUs, mostró resistencia total y hubo muy poca diferencia en la proporción de cultivos susceptibles o positivos entre el grupo de EUs y el control, a esta alta dosis. Sin embargo, la comparación del promedio de los niveles de p24, reveló una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos.

 

Modelaje de la prueba, por la descarga o reto de CMSPs de controles normales a tres dosis diferentes, alta, media y baja:

 

Con este sistema podríamos distinguir entre pequeñas diferencias en la respuesta, permitiéndonos hallar bajas o moderadas respuestas a una vacuna. Con la dosis alta, encontramos que todas las muestras de los 59 voluntarios controles, fueron positivas, con un rango relativamente estrecho de valores de p24 y baja variación entre réplicas de los cultivos. A la dosis intermedia, el 96 % de las réplicas fueron positivas, aunque la variación entre las réplicas positivas se incrementó moderadamente. A la dosis más baja, aún el 67 % de las réplicas fueron positivas. Es así como obtuvimos un gradiente de respuesta, el cual nos permite tomar decisiones en el caso de la evaluación de respuesta a una vacuna experimental.

 

Modelaje de la prueba, utilizando Beta- quimioquinas a dosis subloqueantes para CMSPs de controles normales:

 

Dado que es de esperar que las vacunas a evaluar con esta prueba, induzcan una resistencia parcial y no absoluta, utilizamos un modelo experimental, el cual simula una resistencia intermedia o parcial. Para este modelo, agregamos a los cultivos celulares, dosis subloqueantes de Beta quimioquinas, con el objeto de disminuir el número de co-receptores para el virus, durante el proceso de infección, al tiempo de la descarga o reto in vitro.

 

Modelaje de la prueba, agregando células CD8+ procedentes de LTNPs, a los cultivos de CMSPs privadas de células CD8+:

 

En este caso  a CMSPs de LTNPs, los cuales muestran  resistencia en nuestro sistema de reto o descarga viral in vitro, se las sometió al proceso de separación de subpoblaciones celulares, extrayendo aquellas CD8+. A las células CD4, se les aplicó la descarga con el VIH-1, luego de ser reconstituidas con porcentajes crecientes de sus CD8, dejando un grupo control sin reconstituir.

 

Conclusiones:

 

Tenemos una prueba de laboratorio la cual utiliza CMSPs, en lugar de células construidas por ingeniería genética o transformadas o alogenéicas. La estimulación de los cultivos con anti CD3 e IL-2 es relativamente suave y comparable con dicho aspecto en la infección natural, en contraste con la fuerte estimulación con fitohemaglutinina (PHA) a la cual son sometidos rutinariamente los cultivos con propósito de aislamiento viral.

 

La prueba permite la disección de componentes para estudios mecanísticos, como por ejemplo, separación de subpoblaciones celulares, aspectos genéticos y moleculares, PCR, aplicaciones de la genómica y la proteómica etc.

 

Múltiples mecanismos moleculares podrían estar involucrados en la demostración de resistencia al virus que se observa en este ensayo in vitro. La prueba facilita el estudio de factores solubles, citocinas y quimioquinas y permite el incremento o la disminución de diversos componentes inmunológicos presentes. Puede realizarse con células frescas o criopreservadas.  Permite el uso de aislados primaries, cepas de varios subtipos o clades y de diversos tropismos celulares.

 

La resistencia in vitro correlacionó con la baja carga viral, la presencia de actividad CTL CD8 y el incremento de la producción de Beta quimioquinas. Se demostró que en esta prueba, presentan resistencia los infectados sintomáticos, los altamente expuestos no infectados, los VIH-1 seronegativos infectados con VIH-2 y algunos vacunados experimentalmente.

 

El ensayo es relativamente simple o sencillo y de costo relativamente bajo. Es reproducible en laboratorios con una infraestructura aceptable en la gran mayoría de países o regiones.

 

Su cuantitividad le permite juzgar muestras a nivel individual o de grupos o población. Valora ligeros cambios cuantitativos en la resistencia, permitiendo la interpretación a dosis variables. Por lo tanto, califica respuestas incompletas o parciales, como podría esperarse luego de una vacunación.

 

Esta prueba es susceptible a modulaciones múltiples, por ejemplo, la utilización de varias dosis virales, para lograr respuestas a diferentes niveles, la introducción de muestras procedentes de expuestos no infectados, los cuales presentan un nivel intermedio o parcial de resistencia al virus en este ensayo, el agregado de niveles subóptimos de Beta quimioquinas, y la reconstitución del cultivo con porcentajes crecientes de células CD8.

 

No se pretende conocer aun si correlaciona altamente con protección in vivo, luego de la vacunación. Para ello tendremos que esperar el desarrollo de los acontecimientos en cuanto a la producción de vacunas eficaces, para poder evaluar su potencial en este aspecto. Esta nueva prueba comienza ahora a ensayarse, dentro de los programas de evaluación de protocolos para vacunas experimentales anti VIH/SIDA del HIVTN (HIV Vaccine Trials Network).

 

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